CRISPR-Cas9基因编辑工具凭借其高效、易用、灵活特性极大的改变了传统育种手段，研究人员为了扩大其靶向范围，设计了一系列SpCas9变体，包xCas9（识别5′-NG-3′、5′-GAA-3′、5′-GAT-3′ PAM）、SpCas9-NGv1和SpCas9-NG（识别5′-NG-3′ PAM）以及PAM-less SpRY然而，这些PAM-relaxed Cas9核酸酶是否会造成向导RNA依赖的非特异性脱靶效应，有待于进一步更全面、更准确的探究及评价。

将PAM松弛型Cas9变体和高效胞苷/腺苷脱氨酶的组合可以进行高度灵活的碱基编辑，极大拓展了碱基编辑工具的使用范围。前期研究表明CBE和ABE中脱氨酶可能在基因组中非特异性地催化脱氨反应，从而导致不依赖gRNA的脱靶效应。ABE可以在人类细胞的RNA水平上广泛的产生脱靶，但尚不清楚ABE变体ABE8e是否会在植物中产生脱靶突变。针对不同类型PAM松弛型编辑器，需要对其编辑活性、编辑纯度、编辑窗口、位点偏好、特异性等关键编辑特性进行可靠全面的评价。

近日，扬州大学江苏省作物基因组学和分子育种重点实验室基因编辑团队张勇、张韬教授与马里兰大学YiPing Qi博士课题组合作于《Plant Biotechnology Journal》发表了题名《Genome-wide analyses of PAM-relaxed Cas9 genome editors reveal substantial off-target effects by ABE8e in rice》的研究论文。该研究以水稻为模型，基于“WGS+大数据”分析策略，针对PAM松弛型Cas9核酸酶（xCas9、Cas9-NGv1、Cas9-NG、SpRY）、胞嘧啶碱基编辑器（nCas9-NG-PmCDA1、nSpRY-PmCDA1）以及腺嘌呤碱基编辑器（nSpRY-ABE8e）等介导的植物基因组编辑脱靶效应进行有效解读，并讨论了植物基因编辑过程中由于组织培养引起的体细胞变异的时间线、分子机制及减少基因编辑过程中体细胞突变的可行性，为CRISPR-Cas9植物基因组编辑工具的研究及实践应用提供了可靠支撑。

首先，作者比较了水稻基因组编辑事件单株重复水平下的脱靶偏好性，发现SpCas9-NGv1和SpCas9-NG分布共享了5、1个脱靶突变，而nSpCas9-NG-PmCDA1中则没有相同的脱靶突变（（图1a、1b、1c），随后作者比较了在相同gRNA下不同编辑系统的脱靶偏好性，发现SpCas9核酸酶系统（SpCas9-NGv1和SpCas9-NG）之间共享了4个潜在脱靶突变并且与SpCas9碱基编辑器（nSpCas9-NG-PmCDA1）没有共享任何潜在脱靶突变（图1d），这暗示了Cas9核酸酶系统和碱基编辑系统可能在脱靶上发生了不同机制。